Post-translačné modifikácie: Kľúčové mechanizmy v bunkovej biológii

Post-translačné modifikácie (PTM) sú "molekulárne prepínače", ktorými bunka dynamicky riadi funkciu, lokalizáciu a stabilitu proteínov. Acetylfosfometylové protilátky predstavujú vysoko špecializovanú, no mimoriadne dôležitú skupinu protilátok zameraných na detekciu post-translačných modifikácií (PTM).

Prečo sú PTM-špecifické protilátky kľúčové?

Meranie celkovej hladiny proteínu (napr. pomocou štandardnej protilátky vo Western Blote) často neposkytuje úplný obraz. Proteín môže byť v bunke prítomný, ale ak nie je správne modifikovaný (napr. fosforylovaný), je neaktívny. PTM-špecifické protilátky nám umožňujú študovať tento dynamický stav.

Typy post-translačných modifikácií a protilátky na ich detekciu

Naša ponuka (napr. od Elabscience®) pokrýva tri hlavné typy modifikácií:

1. Fosforylačné protilátky (Fosfo-špecifické)

Toto je najdôležitejšia a najširšia skupina. Fosforylácia (pridanie fosfátovej skupiny enzýmami nazývanými kinázy) je hlavným mechanizmom prenosu signálu v bunke (signal transduction). Tieto protilátky sú navrhnuté tak, aby rozpoznali proteín, len ak je fosforylovaný na špecifickom mieste (napr. "anti-p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)").

Aplikácia: Kľúčové pre štúdium bunkovej signalizácie, odpovede na rastové faktory alebo stres. Pri Western Blote sa takmer vždy používajú v páre: jedna protilátka na detekciu celkového proteínu (Total-ERK1) a druhá na detekciu aktívnej, fosforylovanej formy (Phospho-ERK1).

2. Acetylové protilátky

Acetylácia (pridanie acetylovej skupiny) je kľúčová modifikácia pri regulácii génovej expresie. Najčastejšie sa študuje acetylácia histónov. Acetylované históny sú spojené s "uvoľnenou" štruktúrou chromatínu (euchromatín), ktorá umožňuje transkripciu génov. Protilátky (napr. "anti-Acetyl-Histone H3 (Lys9)") sú nevyhnutné pre výskum epigenetiky, starnutia a rakoviny.

3. Metylové protilátky

Metylácia (pridanie metylovej skupiny) je tiež kľúčovou epigenetickou značkou, najmä na histónoch. Na rozdiel od acetylácie, metylácia môže gény aktivovať aj potláčať, v závislosti od toho, ktoré miesto (lyzín alebo arginín) je modifikované. Tieto protilátky (napr. "anti-Methyl-Histone H3 (Lys4)") sú kritické pre štúdium epigenetickej regulácie.

Kvalita a validácia protilátok

Tieto protilátky (napr. od Elabscience®) patria medzi najťažšie na výrobu a validáciu, pretože musia byť extrémne špecifické. Musia rozpoznať len modifikovaný proteín a nie jeho nemodifikovanú formu. Preto sú prísne testované v aplikáciách ako WB, IHC a prietoková cytometria.

Príklady aplikácií PTM v bunkovej biológii

Špecializované protilátky na post-translačné modifikácie (PTM), ako sú acetylácia, fosforylácia a metylácia, sú kľúčové pre výskum bunkovej signalizácie a regulácie génov. Naša ponuka zahŕňa rozmanitú kolekciu vysoko špecifických protilátok (napr. od Elabscience) na detekciu acetyl/fosfo/metyl skupín, vhodných pre aplikácie ako Western Blot (WB) alebo IHC.

Študujete signálne dráhy alebo epigenetické zmeny a potrebujete spoľahlivo analyzovať fosforylovaný alebo acetylovaný stav vášho cieľového proteínu?

VE Cadherin a post-translačné modifikácie

VE Cadherin zohráva dôležitú úlohu v biológii endotelových buniek prostredníctvom kontroly súdržnosti a organizácie medzibunkových spojení. Spája sa s alfa-katenínom a vytvára spojenie s cytoskeletom.

• Špecifickosť tkaniva: Endotelové tkanivo a mozog, obsahuje 5 kadherínových domén.
• Post-translačné modifikácie: fosforylované na tyrozínových zvyškoch pomocou KDR/VEGFR-2. Defosforylované PTPRB.
• Bunková lokalizácia: bunkové spojenie, bunková membrána, nachádza sa medzi spojením bunka-bunka a pravdepodobne aj bunka-matrix.
• Imunogén: Syntetický peptid zodpovedajúci ľudskému VE-kadherínu aa 750 na C-koniec konjugovaný s hemokyanínom prílipky (keyhole limpet). Pozitívna kontrola: ICC/IF: bunky HUVEC.

Rekombinantné proteíny a ich význam

Rekombinantné proteíny sú molekuly vyrobené pomocou techník génového inžinierstva. Gén kódujúci požadovaný proteín (napr. ľudský rastový faktor) je vložený do hostiteľského organizmu, ktorý potom tento proteín produkuje vo veľkom množstve. Tento proces umožňuje výrobu takmer akéhokoľvek proteínu v laboratórnych podmienkach.

Výber hostiteľského systému (napr. baktérie E. coli, kvasinky, hmyzie bunky Sf9 alebo cicavčie bunky ako HEK293 a CHO) je kritický, pretože ovplyvňuje finálne vlastnosti proteínu, najmä post-translačné modifikácie (ako je glykozylácia), ktoré sú často nevyhnutné pre plnú biologickú aktivitu.

Náš sortiment (Elabscience, TargetMol) ponúka tisíce vysoko čistých a biologicky aktívnych proteínov, vrátane cytokínov, rastových faktorov, enzýmov, CD antigénov a proteínov kontrolných bodov imunitného systému (checkpoint proteins). Potrebujete aktívny rastový faktor (napr. FGF, EGF) pre vaše bunkové kultúry, purifikovaný enzým pre biochemický test, alebo rekombinantný antigén ako štandard pre ELISA?

Translácia a transferové RNA

Translácia predstavuje konečný proces realizácie genetickej informácie štruktúrnych génov. Prebieha na ribozómoch v cytoplazme alebo membránach endoplazmatického retikula za účasti transferových RNA (tRNA), ktoré do ribozómov prinášajú jednotlivé aminokyseliny. Na ribozómoch, ktoré sú akýmisi miniatúrnymi továrňami na výrobu bielkovín, prebieha polymerizácia aminokyselín do súvislého polypeptidového reťazca na základe genetického kódu.

Transferové RNA sú typom funkčných RNA, ktoré slúžia na prepravu, alebo transfer (odtiaľ ich názov), jednotlivých aminokyselín do ribozómu, kde sa z nich tvorí súvislý polypeptidový reťazec.

Ribozómy a proces translácie

Ribozómy tvoria súčasť každej prokaryotickej a eukaryotickej bunky. Ich úlohou je syntéza proteínov v procese translácie. V priemere majú ~20 nm a skladajú sa zo 65% ribozomálnej RNA (rRNA) a 35% ribozomálnych proteínov. Predstavujú teda komplex ribonukleovej kyseliny a proteínov (ribonukleoproteínový komplex).

Vplyv post-translačných modifikácií na funkciu mitochondrií

Post-translačné modifikácie proteínov predstavujú účinný spôsob, ako sa bunky prispôsobujú zmenám prostredia, a významne modulujú vlastnosti proteínov. Sukcinylácia lyzínu má veľký vplyv na funkciu proteínu, pretože dramaticky mení jeho náboj. V eukaryotoch ovplyvňuje najmä mitochondriálne proteíny, keďže donor sukcinátu, sukcinyl-CoA, sa primárne tvorí v Krebsovom cykle.

Mitochondriálny nukleoid, komplex mtDNA a proteínov, je štruktúra, ktorej proteíny ovplyvňuje sukcinylácia. Zistili sme, že Abf2, hlavná zložka nukleoidu S. cerevisiae zodpovedná za zbaľovanie mtDNA, sa môže sukcinylovať na 13 lyzínoch. In vitro štúdie ukázali, že sukcinylácia Abf2 vedie k inhibícii jeho DNA-väzobnej aktivity a znižuje jeho citlivosť voči štiepeniu proteázou ScLon.

Projekty:

• VEGA 02/0075/18 - Faktory ovplyvňujúce dynamiku mitochondriálneho nukleoidu (Factors influencing mitochondrial nucleoid dynamics)
• APVV-15-0375 - Posttranslačné modifikácie v mitochondriách a ich úloha v patologických procesoch (Posttranslational modifications in mitochondria and their role in pathological processes)
• APVV-19-0298 - Vzájomná inerakcia proteáz, šaperónov a kináz v mitochodriách pri strese spôsobenom patologickými stavmi (Mutual interaction of proteases, shaperones and kinases in mitochondria in stress caused by pathological conditions)

Publikácie:

• FRANKOVSKÝ, J.* - KERESZTESOVÁ, B.* - BELLOVÁ, J. - KUNOVÁ, N. - ČANIGOVÁ, N. - HANAKOVÁ, K. - BAUER, J. - ONDROVIČOVÁ, G. - LUKÁČOVÁ, V. - SIVÁKOVÁ, B. - ZDRÁHAL, Z. - PEVALA, V. - PROCHÁZKOVÁ, K. - NOSEK, J. - BARÁTH, P.** - KUTEJOVÁ, E.** - TOMÁŠKA, Ľ.** The yeast mitochondrial succinylome: Implications for regulation of mitochondrial nucleoids. In Journal of Biological Chemistry, 2021, vol. 297, no. 4, no. 101155 [16] p. (2020: 5.157 - IF, Q2 - JCR, 2.361 - SJR, Q1 - SJR, karentované - CCC).
• KOTRASOVÁ, V.* - KERESZTESOVÁ, B.* - ONDROVIČOVÁ, G. - BAUER, J. - HAVALOVÁ, H. - PEVALA, V. - KUTEJOVÁ, E.** - KUNOVÁ, N** Mitochondrial kinases and the role of mitochondrial protein phosphorylation in health and disease. In Life-Basel, 2021, vol. 11, p. 82. (2020: 3.817 - IF, Q2 - JCR, 0.973 - SJR, Q1 - SJR, karentované - CCC).
• HAVALOVÁ, H.* - ONDROVIČOVÁ, G.* - KERESZTESOVÁ, B. - BAUER, J. - PEVALA, V. - KUTEJOVÁ, E.** - KUNOVÁ, N.** Mitochondrial HSP70 chaperone system - the influence of post-translational modifications and involvement in human diseases. In International Journal of Molecular Sciences, 2021, vol. 22, no. 8077. (2020: 5.924 - IF, Q1 - JCR, 1.455 - SJR, Q1 - SJR, karentované - CCC).

tags: #post #translacne #modifikacie